Multiple molecular forms of pyridinoline crosslinks generated by the action of cathepsin B on bone collagen: Influence of high calcium concentrations

Abstract

We investigated in vitro the ability of cathepsin B, a lysosomal cysteine proteinases, to generate multiple molecular forms of pyridinoline crosslinks from insoluble bone type I collagen, and we studied the effects of various concentrations of divalent ions such as calcium (Ca²⁺) and magnesium (Mg²⁺) on this process. Our results have shown that the addition of either Ca²⁺ or Mg²⁺ greatly enhanced the release of pyridinoline crosslinks, the greatest effects being obtained at 50-75 mM. By dialysis and gel filtration chromatography methods, we attempted to separate the different molecular species of peptides containing pyridinoline crosslinks resulting from the digestion of bone with catepsin B. In a Ca²⁺ and Mg²⁺ free buffer, the molecular weight of approximately 80% of the peptide fragments containing crosslinks was under 3500 Da. Addition of MgCl₂ (40 mM) did not modified significantly this repartition, while CaCl₂ changed it dramatically. Indeed, in presence of various concentrations of CaCl₂ (10-40 mM), the proteolytic balance of the enzyme was shifted toward the release of peptide-bound crosslinks fragments with higher size (MW > 3500 Da). These data could suggest that locally elevated concentrations of Ca²⁺, such as those seen in the bone-resorbing microenvironment, could modify the proteolysis of bone collagen mediated by lysosomal cysteines proteinases.

Keywords: pyridinolines crosslinks, Calcium, Cathepsin, collagen, bone matrix degradation

La présente étude porte sur la capacité in vitro d’une cystéine protéinase lysosomiale, la cathepsine B, de générer les formes moléculaires multiples de pyridinolines, à partir du collagène osseux insoluble de type I, et d’étudier les effets de diverses concentrations des ions bivalents tels que le calcium (Ca²⁺) et le magnésium (Mg²⁺) sur ce processus. Les résultats obtenus ont montré que l'addition de Ca²⁺ ou de Mg²⁺ a considérablement augmenté le dégagement des molécules de pyridinoline, les plus importants effets étant obtenus à 50-75 mM. Par dialyse et des méthodes chromatographiques sur gel filtration, nous avons séparé les différentes formes moléculaires de pyridinolines conjuguées résultant de la digestion de l'os par la cathepsine B. Dans un tampon libre de Ca²⁺ et de Mg²⁺, le poids moléculaire (MW) de pyridinolines conjuguées était au-dessous de 3500 Da (80%). L'addition de MgCl₂ (40 mM) n’a pas modifié sensiblement cette répartition, alors que le CaCl₂ la changeait nettement. En effet, en présence de différentes concentrations de CaCl₂ (10-40 mM), l'équilibre protéolytique de l'enzyme a été décalé vers le dégagement de pyridinolines conjuguées ayant un poids moléculaire plus élevée (MW > 3500 Da). Ces données suggèrent que des concentrations en Ca²⁺ localement élevées, comme celles vues dans le micro-environnement de la résorption osseuse, ont pu modifier les sites protéolytiques du collagène osseux par l’intervention de la cystéine protéinase lysosomiale.

Mots clés: Molécules de pyridinolines; Calcium, Cathepsine; collagène; dégradation de la matrice osseuse.