Tropical Maize (Zea mays L.) Genotypes Respond Differently to Agrobacterium-mediated Genetic Transformation

Abstract

አህፅሮት

በጄኔቲክስ ምህንድስና (Genetic engineering) ዝርያዎችን የማሻሻል ሥራዎችን የበለጠ ስኬታማ ለማድረግ የትሮፕካል በቆሎ ዝርያዎች አግሮባክቲሪዬም ቱሚፋሲንስ ባክቴሪያን  መሰረት ላደረገ የጄኔቲክስ ለውጥ (Agrobacterium-mediated Genetic transformation) ተስማሚነታቸውና በቲሹካልቸር የመባዛት አቅማቸው በቅድሚያ መገምገም ይኖርበታል፡፡ የዚህም ጥናት ዋና ዓላማ ከዚህ በፊት በቲሹካልቸር ለማባዛት የተገመገሙና ምቹ በመሆናቸው የተለዩትን  ስድስት የትሮፕካል አፍሪካ የበቆሎ ዝርያዎችን አግሮባክቲሪዬም ቱሚፋሲንስ ባክቴሪያን  መሰረት ላደረገ የጄኔቲክስ ለውጥ (Agrobacterium-mediated Genetic transformation) ተስማሚነታቸው መገምገምና ወደፊት በጄኔቲክስ ምህንድስና ዘረ-መሎችን ለመቀበል ምቹ የሆኑ ዝርያዎችን መለየት ነው፡፡ በጥናቱም  ኢ. ኤች. ኤ. 101 (EHA 101) የተባለ የአግሮባክቶሪየም ቱሚፋሲንስ ባክቴሪያ ዝርያ (Agrobacterium tumefaciens strain) በተሸጋጋሪ የዲ. ኤን. ኤ. ክልል (T-DNA region) መጠኑ 4 ኪሎ ቤዝ ጥንድ (4 kilo base pair) የሚሆን P_SARK::IPT::NOST and P_CMPS::PMI::NOST የያዘ pNOVIPT1 vector ተሸክሞ እናት በቆሎ ተክሎች ከተዳቀሉ ከ16 ቀናት በኋላ የተገኙ ፅንስ ተክሎችን (Immature zygotic embryos) ለማጥቃት ጥቅም ላይ ውሏል፡፡ በዚህ የጄኔቲክስ ምህንድስና የተለወጡ ፅንስ ተክሎችን ለመለየት የፎስፎማኖስ አይሶምራስ (Phosphomanose isomerase enzyme) አመንጪ ዘረ-መል እና ማኖስ የሚባል የስኳር ውሑድ በሚዲያ ውስጥ በመጨመር ተሞክሯል፡፡ በዚህ ጥናት የጄኔቲክስ ለውጥ (Genetic transformation) ስለመከሰቱ ከመሠረቱ ለማወቅ የማኖስ ውሑድ በተጨመረበት ሚዲያ ላይ ያደጉ ተክሎች በዲ. ኤን. ኤ ደረጃ በፒ. ሲ. አር (PCR): ሳዉዜርን ብሎት (Southern blot) እና አር. ቲ. ፒ. ሲ. አር (RT-PCR) በመጠቀም ትንተና ተደረጎ የተሸጋጋሪ ዘረ-መል መኖር፤ የተሸጋጋሪ ዘረ-መል ከበቆሎ ዲ.ኤን.ኤ (DNA) ጋር መወሃዱንና ራሱን መግለፁ ተረጋግጧል፡፡ የዚህ ጥናት ውጤት እንዳመለከተው በቲሹካልቸር ለመራባት ተስማሚ የሆኑ የትሮፕካል በቆሎ ዝርያዎች አግሮባክቲርየም ባክተርያን መሠረት በማድረግ የጄኔቲክስ ምህንድስናን (Agrobacterium-mediated Genetic transformation) ምቹነታቸው እንደየበቆሎ ዝርያዎች ባህርይ ይለያያል፡፡ በጥናቱ ከታዩት ስድስት ዝርያዎች ከዓለም ዓቀፍ የስንዴና በቆሎ ምርምር ማዕከል (CIMMYT) የተገኘ ሲ. ኤም. ኤል. 216 (CML216) እና ከኢትዮጵያ የግብርና ምርምር ኢንስቲትዩት የተገኘ መልካሳ-2 (Melkassa-2) የተባሉ ዝርያዎች ወደፊት በኢትዮጵያም ሆነ በመካከለኛውና ምስራቃዊ አፍሪካ በቆሎ አብቃይ አከባቢዎች በቆሎን የሚያጠቁ ህያውና ህያው ያልሆኑ የምርት ተግዳሮቶችን ለመቋቋም የሚረዱ ዘረ-መሎችን አግሮባክቲሪዬም ቱሚፋሲንስ ባክቴሪያን  መሰረት ባደረገ የጄኔቲክስ ለውጥ (Agrobacterium-mediated Genetic transformation) በጄኔቲክስ ምህንድስና ለማሻሻል አመቺ መሆናቸው ታውቋል፡፡

The current study was designed to evaluate and ascertain genetic transformability of regenerable genotypes using Agrobacterium-mediated transformation method and to identify genotype(s) which can be used as better transgene recipient in future research. The super virulent Agrobacterium strain EHA 101 harbouring the binary vector pNOVIPT1 carrying the 4 Kbp T-DNA region, which included the P_SARK::IPT::NOST and P_CMPS::PMI::NOST expression cassettes, was used to infect immature zygotic embryos harvested 16 days after pollination. The phosphomannose-isomerase gene was used as a marker to select transgenic events on Linsmaier and Skoog selection medium having 5 g/l mannose as a selective agent. Molecular analyses of transgenic plants were carried out using polymerase chain reaction, Southern blot and semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction which, respectively, indicated the presence, stable integration and expression of the transgene. The study indicated genotype dependent response of tissue culture, proficient elite African tropical maize to Agrobacterium-mediated genetic transformation and possibility of enhancing the genetic basis of tropical maize through genetic engineering using Agrobacterium. Among the six maize genotypes tested, the CIMMYT inbred line CML216 and the Ethiopian open-pollinated variety Melkassa-2 produced normal and fertile transgenic plants and were identified for future use in genetic transformation aiming to overcome biotic and/or abiotic stresses of high priority in affecting maize production in the East and Central African region.