Purification and characterisation of alkaline phosphotase enzyme from the periplasmic space of Escherichia coli C90 using different methods.

Abstract

Alkaline phosphotase enzyme was purified from bacteria Escherichia coli C90 grown in phosphate-poor medium as stationary phase; using an ion exchange column packed with DEAE-cellulose as matrix and size exclusion chromatography using Sepharcryl S-300HR, equilibrated with Buffer A. The enzyme was extracted from the periplasmic space, external to the cell membrane. Previous studies with E. coli have shown increase in alkaline phosphatase activity upon phosphate deprivation with much of the enzyme released into the medium during osmotic shock, indicating that the enzyme is located either in the periplasmic space or is loosely bound to the cell wall. Initially, a DEAE column was used leading to 28% yield and 77 times fold purification, followed by Sephacryl gel filtration column giving 25% yield and 72 times fold purification; indicating loss of enzyme in the subsequent purification step. SDS PAGE analysis was carried out as a control and to compare the results with the spectroscopy. There was no clear decrease in the yield seen in the bands and the loss of enzyme was not observed with the gel analysis. It may, therefore, be assumed that the decrease in yield was due to some pipetting errors in the spectroscopy measurements. The native gel results show clear distinct bands for the 3 alkaline phosphotase isoenzymes, confirming that, the purification procedure for the enzyme was a success.

Key Words: DEAE cellulose, SDS PAGE analysis, Sephacryl S-300HR

L’enzyme phosphatase alkaline était purifié de la bactérie Escherichia coli C90 cultivé dans un médium pauvre en phosphate comme phase stationnaire utilisant une colonne d’échange d’ion enveloppée avec une cellulose DEAE comme matrice et exclusion de taille chromographique utilisant le Sepharcryl S-300HR équilibré avec le tampon A. L’enzyme était extraît de l’espace périplasmique externe à la membrane cellulaire. Des études antérieures avec E. coli ont montré une augmentation en activité de la phosphatase alkaline sur la déficience en phosphate avec plus d’enzymes ejectés dans le media Durant le choc osmotique, montrant que l’enzyme est situé dans l’espace périplasmique ou simplement lié à la membrane cellulaire. Initialement, une colonne de DEAE était utilisée avec pour rendement 28% et purifiée 77 fois, suivie d’une colonne de gel de filtration Sephacryl produisant 25% et 72 fois de purification; indicant une perte d’enzyme au cours de l’étape suivante de purification. L’analyse SDE PAGE était conduite comme control et pour comparer les résultats avec la spectroscopie. Il n’y avait pas une diminution claire du rendement dans les bandes et la perte d’enzyme n’était pas observée par l’analyse du gel. Il pourrait être présumé que la diminution du rendement était due aux erreurs de pipettage lors des mesures spectroscopiques. Les résultats du gel natif montrent clairement des bandes distinctes pour 3 isoenzymes alkalines phosphatases confirmant que, la procédure de purification pour l’enzyme était un success.

Mots Clés: cellulose DEAE, analysise SDS PAGE, Sephacryl S-300HR